A separação do Panamá da Colômbia foi um fato que ocorreu em 3 de novembro de 1903, após a Guerra dos Mil Dias, e que resultou na proclamação da República do Panamá, anteriormente um departamento da República da Colômbia desde 1821, com breves períodos de separação do istmo do Panamá.
Após a sua declaração de independência do Reino da Espanha, em 28 de novembro de 1821, o Panamá aderiu voluntariamente a Grã-Colômbia, uma nação formada por Simón Bolívar, que também integrava a Colômbia, o Equador e a Venezuela (incluindo parte da então Guiana) e a Costa dos Mosquitos na Nicarágua.
A luta política entre federalistas e centralistas conduziu a mudanças no estatuto jurídico do Panamá. O país foi portanto, Departamento do Istmo durante os períodos de centralismo e Estado Soberano do Panamá durante os períodos de federalismo. Posteriormente, em 1831 (ano da dissolução da Grã-Colômbia), entre 1840 e 1841 (durante a Guerra dos Supremos, quando se estabeleceu o Estado Livre do Istmo, fazendo um claro registro que reincorporaria a Nova Granada se esta adotasse o sistema federal ) e entre 1899 e 1902 (durante a Guerra dos Mil Dias), o Panamá tenta obter a sua independência.
Em 1846, o Tratado Mallarino-Bidlack, um tratado entre o governo colombiano (na época o país denominava-se República de Nova Granada) e os Estados Unidos. permitiu a construção da ferrovia interoceânica, para a qual se garantiu neutralidade e livre trânsito, e também uma intervenção militar americana foi autorizada que permitia auxiliar a Colômbia a restabelecer a ordem caso a área do istmo estivesse conflagrada por alguma desordem qualquer. No tratado dos Estados Unidos foram obrigados a manter a "neutralidade" no Panamá, em troca de direitos de trânsito no istmo em favor da Colômbia. Isto ocorreria já em 1856 após violentos confrontos entre os panamenhos e estadunidenses em 15 de abril de 1856, na chamada Guerra da Melancia, que levou a primeira intervenção dos Estados Unidos no Panamá. Em março de 1885, a Colômbia diluiu a sua presença militar no Panamá, através do envio de tropas estacionadas ali para lutar contra os rebeldes em outras províncias. Estas condições favoráveis levaram uma revolta no Panamá. A Marinha dos Estados Unidos foi enviada para lá para manter a ordem, tendo em vista invocando suas obrigações de acordo com o tratado assinado em 1846.
Em 1885, os Estados Unidos ocuparam a cidade colombiana de Colón, Panamá. O Chile, que tinha na época a frota mais forte das Américas, enviou o cruzador Esmeralda para ocupar a Cidade do Panamá, em resposta. Ao comandante do Esmeralda foi ordenado parar por quaisquer meios uma eventual anexação do Panamá pelos Estados Unidos
A Guerra dos Mil Dias (1899-1902) foi uma das muitas lutas armadas entre os partidos Liberal e Conservador que devastaram a Colômbia e o Panamá, durante o século XIX.
O Tratado de Wisconsin, assinado em um navio dos Estados Unidos com esse nome, pôs um fim a esta última guerra. No entanto, o líder dos Liberais Victoriano Lorenzo se recusou a aceitar seus termos e foi fuzilado em 15 de maio de 1903.
Em 25 de julho de 1903, a sede do jornal panamenho El Lápiz foi atacada por ordens do comandante militar do Panamá, General José Vásquez Cobo, irmão do então ministro da Guerra da Colômbia, como uma retaliação à publicação de um artigo detalhado narrando a execução e protestos no Panamá. Este evento danificou a confiança dos liberais panamenhos no governo conservador com sede em Bogotá, e que mais tarde se juntou ao movimento separatista.
O descobrimento de ouro na Califórnia, em 1849, revalorizou o papel do istmo como via de comunicação entre as costas oriental e ocidental dos Estados Unidos. Seis anos mais tarde, inaugurou-se a ferrovia, uma das mais promissoras fontes de divisas do governo colombiano, que o levou a empreender múltiplas e intermináveis negociações para a construção do canal, só iniciada em 1880. Em 1878, o francês Ferdinand de Lesseps, construtor do Canal de Suez, obteve uma concessão do governo da Colômbia, autorizando a sua companhia a iniciar as obras de abertura do canal. A companhia encarregada do vultoso empreendimento, de capital majoritariamente francês, interrompeu os trabalhos em 1889 e, em 1898, a obra foi definitivamente paralisada por causa da falência da empresa e problemas de saúde entre a classe trabalhadora (cujo número foi reduzido significativamente devido a doenças como febre amarela e a malária).
O presidente dos Estados Unidos Theodore Roosevelt estava convencido que os Estados Unidos podiam terminar o projeto, e reconheceu que o controle estadunidense da passagem do Atlântico ao Pacífico seria de uma importância militar e econômica considerável. De modo que Roosevelt começou as negociações com os colombianos para obter a permissão necessária. No início de 1903, o Tratado Hay-Herran foi assinado pelos dois países, mas o senado colombiano não o ratificou. Os Estados Unidos, em seguida, moveram-se para apoiar o movimento separatista no Panamá para ganhar controle sobre os resquícios da tentativa francesa de construir um canal.
O político panamenho José Domingo de Obaldía foi selecionado para ser o governador do istmo do Panamá, cargo que havia anteriormente detido, e recebeu o apoio dos movimentos separatistas. Outro político panamenho, José Agustín Arango, começou a planejar a revolução e a separação. Os separatistas desejavam negociar a construção do canal do Panamá diretamente com os Estados Unidos, devido à negatividade do governo colombiano.
A rede separatista foi formada por Arango, Dr. Manuel Amador Guerrero, General Nicanor de Obarrio, Ricardo Arias, Federico Boyd, Carlos Constantino Arosemena, Tomás Arias, Manuel Espinosa Batista e outros. Manuel Amador Guerrero foi encarregado de viajar para os Estados Unidos para conseguir apoio para o plano separatista, ele também ganhou o apoio de importantes líderes liberais do Panamá e o apoio de outro comandante militar, Esteban Huertas.
Com um forte apoio ao movimento separatista, foi definido novembro de 1903 como o momento para a separação. No entanto, os rumores se espalharam na Colômbia, mas a informação gerida ao governo da Colômbia indicou que a Nicarágua estava planejando invadir uma região do norte do Panamá conhecida como Calovébora. O governo implantou tropas do Batallón Tiradores de Barranquilla, e encarregou o comandante para assumir as funções de governador do Panamá, José Domingo de Obaldía e o General Esteban Huertas, que não eram confiáveis pelo governo.
O Batallón Tiradores foi liderado pelos generais Juan Tovar e Ramón Amaya e chegou na cidade panamenha de Colón na manhã de 3 de novembro de 1903. O batalhão sofreu atrasos no seu caminho para a Cidade do Panamá causado pela cumplicidade das autoridades da Ferrovia do Panamá que simpatizavam com o movimento separatista. Após a chegada na Cidade do Panamá, as tropas foram colocadas sob o comando do coronel Eliseo Torres. O General Esteban Huertas, comandante do Batalhão Colômbia no Panamá, ordenou a prisão de Tovar e seus outros oficiais.
A canhoneira colombiana Bogotá disparou projeteis na Cidade do Panamá na noite de 3 de novembro, causando danos e ferindo mortalmente Mr. Wong Kong Yee de Hong Sang, na China.
A canhoneira da Marinha dos Estados Unidos, USS Nashville, comandada pelo Comandante John Hubbard, que também ajudou a atrasar o desembarque das tropas colombianas em Colón, continuando a interferir com a sua missão, alegando que a "neutralidade" da ferrovia tinha que ser respeitada .
Com a enorme repressão das tropas da Junta Revolucionária procedeu-se a declaração da separação do Istmo e depois a independência, com a declaração da República do Panamá. Um esquadrão naval na Baía do Panamá, foi capturado sem resistência. Demetrio H. Brid, presidente do Conselho Municipal do Panamá, tornou-se presidente de facto do Panamá e nomeou, em 4 de novembro de 1903, a Junta de Governo Provisório que governou o país até fevereiro de 1904, quando a Convenção Nacional Constituinte foi estabelecida e elegeu Manuel Amador Guerrero como o primeiro presidente constitucional. A notícia da separação do Panamá da Colômbia chegou a Bogotá em 6 de novembro de 1903 devido a um problema com os cabos submarinos.