La conjuration d'Amboise, ou tumulte d'Amboise, qui a lieu en mars 1560, est une tentative d'enlèvement du roi François II, organisée par un groupe de gentilshommes protestants, dans le but de soustraire le roi à l'influence des Guise, famille hostile au protestantisme.
Cet événement annonce les guerres de Religion qui commencent peu après (1562-1598).
À la suite de la mort du roi Henri II le 10 juillet 1559, les protestants espèrent obtenir la fin de la répression qu'il a menée durant son règne, mais le nouveau roi, François II (1544-1560), confie la première place dans le gouvernement aux Guise, au détriment des Bourbons, pourtant princes du sang, ainsi que des Montmorency.
Le duc François de Guise et son frère le cardinal Charles de Lorraine, oncles maternels de la reine de France Marie Stuart, fille de Marie de Guise, ont par son intermédiaire une forte influence sur le roi. Se considérant comme les garants en France de la religion catholique, ils sont partisans d'une politique de fermeté envers la religion réformée, notamment en s'appuyant sur l'édit d'Écouen du 2 juin 1559. Le supplice d'Anne du Bourg, conseiller au Parlement de Paris, en décembre 1559 marque leur détermination.
Pour se débarrasser des Guise, les protestants comptent sur les deux princes du sang, Antoine de Bourbon et son frère le prince Louis de Condé. Acquis aux idées de la Réforme (Louis plus qu'Antoine, mais celui-ci est l'époux de Jeanne d'Albret, reine de Navarre, calviniste convaincue), ces deux princes ont la légitimité pour gouverner le royaume, mais, à ce moment, ils n'envisagent pas de se mettre en conflit ouvert avec la cour.
Devant leur passivité, un groupe de gentilshommes de province décident alors de prendre les choses en main : ils organisent un complot pour s'emparer du roi et de sa famille par la force.
Le chef de la conjuration est Jean du Barry, seigneur de La Renaudie, gentilhomme périgourdin, très hostile aux Guise depuis l'exécution de son beau-frère Gaspard de Heu en 1558.
Il associe à son projet des nobles originaires de toute la France, comme le baron Charles de Castelnau-Tursan, François Bouchard d'Aubeterre, Edme de Ferrière-Maligny, les capitaines Mazères, Sainte-Marie-d'Aigneaux, Lignières et Cocqueville, Jean d'Aubigné, père d'Agrippa, Jean Hotman, Ardoin des Porcelets de Maillane, François de Barbançon, Charles de La Garaye, René de la Rouveraye.
Paulon de Mauvans, dont le frère a été exécuté, rallie les huguenots de Provence à Mérindol, le 12 février 1560, promet 2 000 hommes et en envoie 100 à Nantes où les conjurés doivent se réunir.
Sont également associés plusieurs bourgeois des villes d'Orléans, Tours et Lyon.
Le 1er février 1560, les conjurés se réunissent à Nantes pour mettre au point un plan.
L'attitude réservée des chefs protestants
Les principales personnalités du protestantisme français sont au minimum réservées.
Jean Calvin et la plupart des pasteurs protestants, refusant la voie de la violence, condamnent le projet des conjurés.
L'amiral Gaspard de Coligny empêche la noblesse protestante de Normandie de s'y associer.
Le prince de Condé, désigné par la formule « le capitaine muet » dans les lettres des conjurés, refuse de participer directement à la conjuration, bien que, séjournant à Orléans, il envisage d'en recueillir les fruits[réf. nécessaire], le cas échéant.
Au cours du mois de février, les Guise reçoivent des avertissements concernant l'existence d'un complot. Ils pensent tout d'abord qu'il s'agit d'une opération fomentée à l'étranger.
Le 12 février, ils reçoivent des informations plus complètes de Pierre des Avenelles, un avocat parisien.