La Baltimore and Ohio Railroad (B&O) est la plus ancienne compagnie de chemin de fer américaine. Elle a été la première compagnie à proposer un service au public avec des horaires fixes, tant pour le fret que pour les passagers. Sa première ligne reliait le port de Baltimore (Maryland, États-Unis) à la rivière Ohio près de Wheeling (Virginie-Occidentale, États-Unis).
Elle a été classée chemin de fer américain de classe I. Elle a existé de 1827 à 1986, et la première section de ligne a été mise en service en 1830. Elle fait partie aujourd'hui de la compagnie CSX qui tire son origine de la fusion de nombreuses autres compagnies de la côte orientale de l'Amérique du Nord (États-Unis et Canada) de tailles plus réduites. La compagnie est devenue célèbre aux États-Unis en devenant une des quatre compagnies ferroviaires de la version américaine du célèbre jeu de société Monopoly.
Philip E. Thomas et George Brown furent les fondateurs de la compagnie. Ces derniers visitèrent l'Angleterre en 1826 pour étudier le fonctionnement des entreprises locales. Ils se réunirent alors en 1827 pour se financer auprès de commerçants et de banquiers de la région de Baltimore. La compagnie fut lancée et officialisée par la Virginie le 8 mars 1827 en tant que Baltimore and Ohio Rail Road Company avec la ligne reliant le port de Baltimore à la rivière Ohio. Il s'agissait à l'époque de la solution la plus rapide pour transporter les marchandises entre la côte orientale du pays et la région du Midwest. Cette route ferroviaire était bien plus rapide que la voie fluviale du canal Érié près de New York. Philip Thomas fut élu premier président de l'entreprise tandis que George Brown en était le trésorier. Le capital de départ fut fixé à 5 millions de dollars.
La construction de la voie débuta le 4 juillet 1828. Le premier tronçon entre Baltimore et Ellicott's Mills (actuellement Ellicott City (Maryland)) fut ouvert le 24 mai 1830. La voie devait suivre la rivière Patapsco jusqu'à Parr's Ridge pour franchir un dénivelé avant de redescendre dans la vallée des cours d'eau Monocacy et Potomac. D'autres tronçons ouvrirent vers Frederick (Maryland) le 1er décembre 1831, Point of Rocks le 2 avril 1832, Sandy Hook le 1er décembre 1834 en connectant le Winchester and Potomac Railroad, Martinsburg en mai 1842, Hancock en juin 1842, Cumberland le 5 novembre 1842, Piedmont le 21 juillet 1851, Fairmont le 22 juin 1852, et le terminus de Wheeling le 1er janvier 1853. Vingt-cinq ans ont été nécessaires pour construire la ligne de 379 miles (610 km) de long.
L'État du Maryland demanda à la compagnie d'établir une ligne entre Baltimore et Washington D.C. (District de Columbia, États-Unis en 1831. La ligne fut ouverte en 1835. En contrepartie, l'État assurait à la compagnie le monopole de cette relation.
La guerre de Sécession a impliqué à plusieurs reprises les voies ferrées de la compagnie :
Le Great Train Raid of 1861, Mai 1861 ;
Le Martinsburg Train Raid, 20-23 juin, 1861 ;
Le Leesburg Train Raid, 7 août, 1861 ;
Le Romney Expedition, 1 au 24 janvier, 1862 ;
Raids du général de Brigade, A. G. Jenkins, Automne, 1862 ;
Le Jones-Imboden Raid, 24 avril au 22 mai, 1863 ;
La bataille de Monocacy, 9 juillet, 1864 ;
Le Gilmor's Raid, 11 juillet, 1864.
Lieutenant Général Thomas J. Stonewall Jackson ;
Lieutenant Général Jubal Anderson Early ;
Général de Brigade Turner Ashby et sa cavalerie des chevaux noirs ;
Général de Brigade John D. Imboden et la 62e infanterie à cheval de Virginie ;