L'assassinat d'Henri de Lorraine, 3e duc de Guise et chef de la Ligue catholique, a lieu le 23 décembre 1588 dans la demeure royale du château de Blois. Jugé trop influent par le roi de France Henri III et convoqué lors des États généraux de 1588-1589, Henri Ier de Guise, victime d’une conspiration, tombe dans un guet-apens en traversant la chambre du roi et meurt exécuté par les Quarante-Cinq, la garde personnelle royale. Son frère, le cardinal Louis II de Lorraine, est assassiné par la même occasion. Leur mort conduit indirectement à l'assassinat du roi l'année suivante.
Dans le contexte des guerres de religion qui opposent catholiques et protestants, les tensions s'exacerbent lorsque le frère cadet du roi, le duc François d'Anjou, meurt sans héritier en 1584. Le roi Henri III n'en ayant pas lui-même, c'est son cousin germain et beau-frère, le roi Henri III de Navarre, chef protestant (huguenot) de la maison de Bourbon, maison rivale des Guise, qui devient de fait l'héritier du trône de France, sous le nom d'Henri IV.
À la tête d'un puissant clan aristocratique, Henri de Lorraine, duc de Guise, devint populaire pendant les guerres de religion en se posant comme le défenseur de la foi catholique. Après avoir participé au massacre de la Saint-Barthélemy (1572), il s'illustra à plusieurs reprises sur le champ de bataille en combattant les protestants. D'abord prince de Joinville, puis duc de Guise (1563), il tint en tant que grand maître et pair de France, une place d'importance à la cour. Henri de Guise aspirait aussi à gouverner la France. Son but avoué était de réduire l'influence politique du parti protestant en France, en vertu du principe de catholicité de la couronne, mais on ne peut exclure une ambition personnelle appuyée sur une logique de clan et une rivalité entre diverses factions proches du pouvoir et de la famille royale. Il mène alors un mouvement de fronde, connu sous le nom de Ligue catholique ou Sainte Union.
Attisée par la Ligue catholique, la colère et la frustration de la population parisienne à l'égard de l'attitude pro-protestante d'Henri III se déchaînèrent à partir de 1588. Épernon, le dernier favori d'Henri III, devint la cible principale des attaques de la Ligue. En avril, plusieurs tentatives d'enlèvement du roi et d'assassinat d'Épernon eurent lieu, mais elles furent déjouées par Nicolas Poulain, un espion d'Henri III et membre de la Ligue. Craignant une nouvelle Saint-Barthélemy, mais avec les rôles inversés, la Ligue se tourna vers le duc de Guise. Bien qu’Henri III eût interdit à de Guise de se rendre à Paris, sa mère, Catherine de Médicis, l’avait prié, à l’insu du roi, de venir dans la capitale afin de parvenir à un accord entre les deux hommes et d’apaiser la situation dans la ville. Les 10 et 11 mai, des pourparlers eurent lieu entre de Guise et le roi. Cependant, lorsque le roi apprit qu’une révolte se préparait contre lui, il ordonna, dans la nuit du 11 mai, l’occupation de la ville. Les Parisiens, dont le droit ancestral à l’autodéfense avait été bafoué, réagirent avec indignation. Malgré les pressions de sa mère pour qu’il reste en ville, le roi s’enfuit à Chartres le 13 mai.
Une fois que la Ligue eut pris le contrôle de Paris, de Guise entreprit de purger toutes les institutions politiques des personnes fidèles au roi. Le maire et les conseillers municipaux furent sommairement démis de leurs fonctions et remplacés par des membres fidèles à la Ligue. Le Palais de Justice, où siégeait le Parlement, ainsi que les deux plus hautes juridictions du Châtelet, la Chambre des Comptes et la Cour des Aides, furent occupés. En mai et juillet, des négociations eurent lieu entre la Ligue et le roi. De Guise resta inflexible et insista sur l'application du traité de Nemours ainsi que sur l'exil d'Épernon. Sans moyens militaires adéquats et avec une grande partie du nord de la France sous le contrôle de la Ligue, Henri III céda aux exigences de la Ligue en signant l'édit d'Union le 15 juillet.
Le roi réaffirma sa promesse de lutter contre l'hérésie, ce qui entraîna l'exclusion d'Henri de Navarre de la succession au trône. À sa place, le cardinal de Bourbon fut désigné comme héritier du trône. Il se déclara en outre prêt à accorder une amnistie générale à tous ceux qui avaient pris part à la journée des barricades. De plus, il fut contraint de reconnaître la légitimité du gouvernement révolutionnaire à Paris et de nommer de Guise lieutenant général (commandant en chef de l'armée royale). Enfin, le roi fut contraint de convoquer une session des États généraux pour l'automne. Les États généraux, qui se réunirent à Blois en octobre, étaient en grande partie contrôlés par la Ligue à la suite des élections précédentes, marquées par une campagne électorale relativement moderne. Les rôles de direction des trois ordres revinrent à des membres éminents de la Ligue, à savoir le cardinal de Bourbon et de Guise pour le clergé, Charles Ier de Cossé, comte de Brissac, pour la noblesse, ainsi que le maire de Paris, La Chapelle-Marteau, pour le tiers état.
Lors de l'inauguration solennelle du 15 octobre, Henri III souligna dans son discours sa détermination à lutter contre l'hérésie, mais aussi le besoin de fonds pour poursuivre la lutte contre Henri de Navarre et les huguenots. Il promit d'éradiquer la corruption, de favoriser le commerce et de réformer le système fiscal. Il critiqua ensuite le fait que certains grands nobles de son royaume aient conclu des alliances contre lui, mais se dit prêt à pardonner, ce à quoi de Guise exigea que ces allusions insultantes à son égard soient supprimées de la version imprimée du discours du roi.
La lutte pour le pouvoir qui s'ensuivit porta principalement sur le financement de la guerre contre les huguenots et sur la nature juridique de la monarchie. Alors que le clergé exigeait l'éradication totale du protestantisme, le Tiers État réclamait de profondes réformes administratives et judiciaires, une baisse des impôts ainsi que la suppression de la vénalité des charges. La revendication visant à ancrer l'édit d'Union dans les lois fondamentales du royaume et à soustraire les décisions des États généraux au contrôle royal était particulièrement explosive, car elle aurait de fait transformé l'État en une monarchie constitutionnelle.Jusqu’à la mi-décembre, la situation s’aggrava en raison de rumeurs concernant un projet d’enlèvement du roi et l’ambition du duc de Guise d’être nommé connétable de France. Malgré de nombreux avertissements concernant un complot et une violente altercation personnelle dans les jardins du château, le duc de Guise resta à Blois. Catherine de Médicis, gravement affaiblie par la maladie, n’avait plus à cette époque l’influence politique nécessaire pour servir de médiatrice entre les parties. Face à l’impasse politique totale et à la menace d’une destitution, Henri III opta pour une solution violente.
Le 17 décembre, Henri III se réunit avec ses plus proches confidents, le maréchal d’Aumont, le marquis de Rambouillet et Alphonse d’Ornano, afin de trouver un moyen de se débarrasser de Guise. L’idée d’arrêter Guise pour haute trahison fut écartée car jugée irréalisable, ce qui conduisit à la décision de l’assassiner. Comme de Guise était constamment entouré de gardes, il fallait l’isoler de son entourage. Le seul endroit où cela était possible était les appartements privés du roi. Le 20 décembre, Henri III chargea sa garde du corps de tuer de Guise. Au total, environ 40 personnes furent impliquées, parmi lesquelles : François de Montpezat, René de Clermont, Charles de Balzac, Jean-François de Saint-Maline, Peri de Montsériac et Louis des Balbes de Berton de Crillon. Dans les jours qui précédèrent le 21 décembre 1588, les indices d’un complot visant à assassiner de Guise se multiplièrent. Il reçut des avertissements du nonce apostolique, de sa mère ainsi que du duc d'Elbeuf. Dans la nuit du 23 décembre, cinq messages anonymes lui furent également remis, le mettant en garde contre le fait de pénétrer dans les appartements royaux. De Guise ne prêta aucune attention à ces avertissements. Il fit part de son opinion à un de ses accompagnateurs : « Il [le roi] n'osera pas. »