Isabel de Portugal (Lisboa, 24 de octubre de 1503-Toledo, 1 de mayo de 1539) fue la esposa del rey Carlos I de España, emperador del Sacro Imperio Romano Germánico, y por ello emperatriz y reina consorte desde su matrimonio el 10 de marzo de 1526 hasta su muerte en 1539. Ejerció la regencia de Castilla y de Aragón debido a los constantes viajes de su marido por Europa.
Isabel de Portugal era la segunda hija del rey Manuel I de Portugal y de su segunda esposa, María de Aragón, siendo por tanto infanta de Portugal por nacimiento. Recibió el nombre de su abuela materna, Isabel I de Castilla, y de su tía materna, Isabel de Aragón (1470-1498), que había sido la primera esposa de su padre. A lo largo de su vida, muchos la compararían con su abuela Isabel I de Castilla por su carácter y su determinación en la política. Fue la segunda en la línea sucesoria al trono portugués hasta el nacimiento de su hermano Luis en 1506, siendo (por su madre) nieta de los Reyes Católicos, por lo tanto prima hermana de Carlos V. Como hija mayor era la candidata a casarse con su primo hermano Carlos, hijo de la hermana de su madre, Juana I de Castilla, y de su marido Felipe, duque de Borgoña. Por la línea genealógica de su padre, era nieta del infante Fernando, duque de Viseu (segundo hijo del rey Eduardo de Portugal y hermano del rey Alfonso V de Portugal) y de Beatriz de Portugal, hija de Juan de Portugal (hermano del rey Eduardo).
Fue educada bajo la supervisión de su institutriz Elvira de Mendoza. Estudió matemáticas, textos de los clásicos del Renacimiento, las lenguas latina, española y francesa (su idioma materno era el portugués), etiqueta y doctrina cristiana. Aprendió a tocar varios instrumentos musicales y entró en contacto con las distintas corrientes intelectuales propias del humanismo renacentista. Isabel de Portugal y sus hermanos eran castigados por su madre cuando se consideraba oportuno. A los 14 años murió su madre. Ella y su hermana Beatriz heredaron sus propiedades, además de las rentas de Viseu y Torres Vedras.
Su matrimonio traería consigo una fuerte alianza entre España y Portugal, de acuerdo con los deseos de sus abuelos, Isabel I de Castilla y Fernando II de Aragón. Facilitaría además la continuación de la exploración de los océanos sin incurrir en enfrentamientos, ya que Portugal era la única potencia naval que podía desafiar la supremacía de España en el océano Atlántico. Como Carlos era soberano de múltiples reinos, era necesario que Portugal, el reino más rico de la cristiandad y la única potencia naval que podría cuestionar la supremacía de Castilla en el Atlántico, cayera bajo la órbita de España y no de Francia, como había ocurrido en la guerra de sucesión castellana. El consentimiento portugués había permitido que Castilla cimentase su posición en las Canarias y sobre territorios del Reino de Fez y su apoyo era necesario para combatir a los infieles en Berbería. En conclusión, la alianza con Portugal era garantía de paz y estabilidad. Además, como se había criado en Borgoña, los nobles y súbditos españoles al parecer insistieron en que se casara con una princesa de la península ibérica.
Sin embargo, Carlos, de 18 años, no tenía prisa por casarse y, en su lugar, envió a su hermana Leonor de Austria en 1518 a casarse con el padre viudo de Isabel de Portugal. Los consejeros flamencos de Carlos, especialmente Guillermo de Croÿ, lo convencieron más tarde de que relegara la alianza portuguesa a un segundo plano y la sustituyera por una alianza con Inglaterra. En 1521, Carlos se comprometió con su otra prima hermana, María Tudor, hija de Enrique VIII y Catalina de Aragón, que era 16 años más joven que él y todavía una niña. Su compromiso pretendía deshacer una alianza entre Inglaterra y Francia articulada por el ambicioso cardenal Thomas Wolsey basada en el matrimonio entre María Tudor y el Delfín.
Muchos en Portugal se tomaron el rechazo de su infanta como una ofensa, pero Isabel seguía decidida a casarse con su poderoso primo o, de lo contrario, ingresar en un convento.
En 1525, Carlos ya no estaba interesado en una alianza con Inglaterra y no podía esperar más a que María se hiciera mayor porque estaba decidido a tener hijos legítimos. Se canceló su compromiso, se abandonó la alianza con Inglaterra y buscó finalmente casarse con Isabel. Tenía muchas más ventajas: estaba más cerca de él en edad, sólo era 3 años menor que él, hablaba español con fluidez y le ofreció una dote de 900.000 cruzados portugueses o doblas castellanas, que era más que suficiente para resolver muchos de sus problemas financieros provocados por la guerra de Italia de 1521-26. Carlos no perdió tiempo en conseguir una dispensa papal para los primos hermanos y se formalizó el contrato matrimonial para una alianza con Portugal: Isabel se casaría con él y su hermano, el rey Juan III de Portugal, con la hermana menor de Carlos, Catalina de Austria. Carlos pretendía casarse y luego dejar a su futura esposa como regente para gobernar España mientras él iba a Europa Central a ocuparse de los problemas políticos y religiosos de la zona.
En enero de 1526, Isabel viajó a España. A su llegada, se encontró con el duque de Calabria, el arzobispo de Toledo y el duque de Béjar en la frontera hispano-portuguesa. Ellos la escoltaron hasta Sevilla, donde esperaría a Carlos durante una semana. Al final, su boda se celebró al día siguiente, pasada la medianoche del 11 de marzo, en el Real Alcázar de Sevilla, obsequiándola, como regalo de bodas, con el señorío de la ciudad de Albacete y de la Villa de Alcaraz. Aunque su matrimonio fue un acuerdo político, Isabel cautivó a Carlos, que se quedó con ella más tiempo del previsto. Pasaron varios meses de luna de miel en la Alhambra de Granada, donde él encargó las semillas de una flor persa que nunca antes se había visto en España. Las semillas crecieron hasta convertirse en el clavel rojo, que le encantó. Entonces ordenó que se plantarán miles más en su honor, estableciendo el clavel rojo como emblema floral de España. A pesar del afecto mutuo que se profesaban, su matrimonio no fue fácil. Su primera ausencia duró de 1529 a abril de 1533. Permaneció en España dos años, para volver a partir en diciembre de 1536. Aunque regresó brevemente en 1538, se marchó casi inmediatamente, volviendo en noviembre de 1539. Según lo acordado por los nobles, sus hijos se criaron en España. Ella supervisó su educación y les enseñó portugués. Escribía a su marido con regularidad, pero a menudo pasaba meses sin recibir cartas. Tal y como Carlos había planeado, nombró a Isabel regente de España durante su ausencia de la península para que dirigiera sus campañas militares y atendiera la administración de sus otros reinos entre 1529-33 y 1537-39. Asistió a las reuniones de los consejos de gobierno y consultó a los ministros. Con el paso del tiempo, adoptó un papel más activo en el proceso de elaboración de políticas, sugiriendo sus propias soluciones en lugar de limitarse a aceptar recomendaciones. Su marido consideraba sus deliberaciones "muy prudentes y bien pensadas".
Tuvo siete hijos de los que solo sobrevivieron tres:
Felipe (21 de mayo de 1527-13 de septiembre de 1598), sucesor de su padre en el trono de España (juntamente con sus posesiones en América, los Países Bajos, Milán, Cerdeña, Nápoles y Sicilia) con el nombre de Felipe II
María (21 de junio de 1528-26 de febrero de 1603), quien en 1548 se casó con el emperador Maximiliano II de Habsburgo, su primo hermano
Fernando (22 de noviembre de 1529-13 de julio de 1530), muerto de alferecía
Niño muerto al nacer (29 de junio de 1534)
Juana (24 de junio de 1535-7 de septiembre de 1573), quien en 1552 se casó con su primo hermano Juan Manuel de Portugal, infante heredero de Portugal
Juan (19 de octubre de 1537 -20 de marzo de 1538), muerto de alferecía
Niño muerto al nacer (21 de abril de 1539)
Durante varios años, Isabel y la corte viajaron de ciudad en ciudad, en parte para evitar la exposición a epidemias. Se especula con que padecía tisis, y un contemporáneo la describe así: