Maria von Spanien (spanisch: María de Austria) (* 21. Juni 1528 im Alcazar in Madrid; † 26. Februar 1603 in Villamante) war Infantin von Spanien und durch Heirat Kaiserin des Heiligen Römischen Reiches.
Maria war die älteste eheliche Tochter von Kaiser Karl V. und dessen Gemahlin Isabella, Tochter des Königs Emanuel I. von Portugal. Maria wuchs überwiegend in Madrid und Valladolid auf und wurde gemeinsam mit ihrem älteren Bruder Philipp erzogen. Nach dem Tod ihrer Mutter im Jahr 1539 stieg sie zur ranghöchsten Frau am Hof auf.
Maria sollte ursprünglich zwischen 1536 und 1545 einen der Söhne des französischen Königs Franz I. heiraten. Nach dem Schmalkaldischen Krieg beabsichtigte ihr Vater Karl allerdings, die österreichische Linie der Habsburger familiär enger an die spanische Linie zu binden, um so den politischen Zusammenhalt beider Mächte zu sichern und die Macht der Habsburger nicht zersplittern zu lassen. Maria heiratete daher am 13. September 1548 in Valladolid Maximilian, ihren Cousin 1. Grades und späteren Kaiser. Der Ehevertrag war während des Reichstages in Augsburg ausgearbeitet worden. Maria leistete dabei auch den traditionellen Erbverzicht auf alle territorialen Ansprüche, ihr wurde lediglich eine jährliche Rente garantiert.
Von ihrem Vater berufen, übte sie zusammen mit ihrem Ehemann Maximilian II. während der Abwesenheit Kaiser Karls seit 1548 die Regentschaft in Spanien aus. Dabei kam es zwischen ihrer entschieden katholischen Haltung oft zum Widerspruch mit ihrem religiös weniger eindeutigen Ehemann, der zeitweise gar beabsichtigte, in das protestantische Lager zu wechseln.
Seit Oktober 1550 war Maria alleinige Statthalterin in Spanien. Ab 1552 lebte Maria ständig in Wien. Spanien hatte sie an der Seite ihres Mannes, der sie dort abholte, verlassen und die Regierungsgeschäfte ihrem Bruder Philipp übergeben. In Österreich versuchte Maria, auch unter dem Einfluss ihrer Verwandten, ihren Ehemann zur Stellungnahme für den katholischen Glauben zu bewegen. Im Jahr 1562 zur böhmischen und ein Jahr später zur ungarischen Königin gekrönt, wurde sie an der Seite ihres Mannes 1564 römisch-deutsche Kaiserin.
Auf ihre Kinder, darunter die späteren Kaiser Matthias und Rudolf II., hatte sie großen Einfluss. Im ständigen brieflichen Kontakt mit ihrem Bruder Philipp II. von Spanien, gelang es ihr, den Zusammenhalt der beiden habsburgischen Linien in Spanien und dem Heiligen Römischen Reich aufrechtzuerhalten. Im Jahr 1562 schickte sie zwei ihrer jüngeren Söhne nach Spanien, für Philipp II. eine Garantie der Treue Maximilians zum katholischen Glauben.
Nach dem Tod ihres Mannes 1576 blieb sie einige Jahre am Kaiserhof, kehrte aber nach dem Tod ihrer jüngsten Tochter 1582 nach Spanien zurück. Grund für den Umzug waren unter anderem erhebliche Spannungen mit ihrem Sohn Rudolf II. Auch das Verhältnis zu ihrem Bruder Philipp II. erkaltete, doch blieb Maria der wesentliche Faktor in der Verbindung der habsburgischen Linien. Ihre Versuche, die Regierung ihres Enkels Philipps III. zu beeinflussen, scheiterte. In Spanien beschäftigte Maria den Komponisten Tomás Luis de Victoria als ihren Kapellmeister. Maria lebte in Spanien zurückgezogen im Kloster der Descalzas Reales in Madrid, halb als Nonne, halb als Fürstin. Weitestgehend isoliert starb sie dort und wurde dort auch begraben. Lediglich der kaiserliche Gesandte Khevenhüller, den sie zum Vollstrecker ihres Testaments bestimmte, und ihre Tochter Margarete, die ebenfalls als Nonne bei den Descalzas Reales lebte, hatten zuletzt noch Kontakt zu ihr gehabt.
Aus der Ehe mit Maximilian gingen die folgenden Kinder hervor:
⚭ 1570 König Philipp II. von Spanien (1527–1598)
Rudolf II. (1552–1612), Kaiser des Heiligen Römischen Reiches
Ernst (1553–1595), Statthalter in den Niederlanden
⚭ 1570 König Karl IX. von Frankreich (1550–1574)
Matthias (1557–1619), Kaiser des Heiligen Römischen Reiches
⚭ 1611 Erzherzogin Anna von Österreich-Tirol (1585–1618)
Maximilian (1558–1618), Hochmeister des Deutschen Ordens, Titularkönig von Polen
Albrecht VII. (1559–1621), Statthalter der spanischen Niederlande
⚭ 1599 Infantin Isabella Clara Eugenia von Spanien (1566–1633)
Wenzel (1561–1578), Großprior des Johanniterordens in Kastilien